Чем может помочь секвенирование РНК
Когда секвенирования экзома недостаточно для нахождения причины наследственного заболевания, на помощь приходит секвенирование транскриптома.
Полное экзомное секвенирование (определение всех последовательностей ДНК, несущих информацию о структуре белков) становится все более распространенным инструментом в диагностике наследственных болезней, однако лишь 50-75% менделевских заболеваний можно обнаружить при помощи секвенирования экзома.
Дело в том, что причина болезни может быть в мутациях, возникающих в некодирующей части генома. Такие мутации могут влиять на изоформы РНК и, в последствии, на белки, транслируемые с «неправильных» РНК-матриц. Полногеномное же секвенирование способно прочитать все участки генома, включая некодирующие области, однако целевые мутации могут затеряться среди так называемых «мутаций неизвестного значения», куда попадают расположенные в интронах мутации регуляторных элементов и ни на что не влияющие единичные полиморфизмы.
Для решения этой проблемы исследователи предлагают подключать секвенирование РНК. Данный способ позволяет зарегистрировать изменения в количествах РНК, обнаружить все многообразие изоформ РНК, прошедших сплайсинг, а также гены с аллель-специфической экспрессией.
Ученые из Института человеческой генетики провели РНК-секвенирование образцов фибробластов больных с предполагаемыми митохондриальными заболеваниями. Ранее было проведено секвенирование экзомов этих пациентов, но дефекты в генах, которые могли бы вызвать дисфункцию митохондрий, были найдены только у половины больных. В ходе анализа РНК у пациентов было обнаружено 5 вариантов неправильно сплайсированной РНК, 6 вариантов моноаллельной экспрессии редких генов и определен уровень экспресии 1 гена с абберацией. В результате у 10% пациентов, генетическую причину заболеваний которых не удалось обнаружить с помощью экзомного секвенирования, были найдены мутантные гены. После проведения дополнительного протеомного анализа, подтверждающего синтез дефектных белков с обнаруженных генов, пациентам был поставлен точный диагноз. Для 75% больных исследователями были установлены кандидатные гены, ассоциированные с проявлениями митохондриальных расстройств.
Ученые комментируют, что митохондриальные заболевания часто возникают на фоне дефектов сплайсинга и только РНК-секвенирование может помочь их зарегистрировать. Например, если во время сплайсинга в мРНК ошибочно включается интрон, то такое изменение не может быть обнаружено при помощи секвенирования экзомов. Обнаружение «loss-of-function» мутаций, то есть аббераций, приводящих к снижению или потере белком его функций, на уровне РНК помогает отобрать для пристального изучения те редкие полиморфизмы генов, которые скрывались среди «мутаций неизвестного значения» в массиве данных после полногеномного секвенирования. Если использование частоты встречаемости того или иного полиморфизма гена в качестве критерия отбора является эффективным подходом при скрининге кодирующей области, то исследование интронов и межгенных участков требует применения особых методов.
Кроме того, РНК-секвенирование позволяет получить дополнительную информацию о расположении интронов, которые могут повлиять на неправильный сплайсинг. По наблюдению исследователей, зрелые мРНК с новыми, дополнительными экзонами в составе часто берут начало от пре-мРНК с очень низким уровнем транскрипции. Скорее всего, изменения в таких первичных транскриптах вызывают активацию так называемых скрытых сайтов сплайсинга, что ведет к присоединению части интрона и появлению нового экзона. Ученые предлагают создать единую базу, содержащую данные РНК-анализа различных тканей здоровых индивидуумов, для составления специальных тканеспецифических карт, несущих информацию о расположении скрытых сайтов сплайсинга. Это поможет более прицельно проводить поиск РНК с дефектами сплайсинга, и быстрее выделять соответствующую мутацию в интроне.