8 февраля 2018

Какие дополнительные возможности есть у нашего трансляционного аппарата и что может их «запустить»?

За последние 2 месяца вышли три независимых публикации, описывающие вклад дипептидных повторов в развитие патологий нервной системы на молекулярном уровне. Такие дипептидные повторы образуются в ходе трансляции многократно повторяющихся (до тысячи повторов) нуклеотидных последовательностей GGGGCC, расположенных в первом интроне гена C9ORF7. Как происходит такое «нарушение» законов молекулярной биологии, и какие факторы являются триггерами для запуска неканонических трансляционных механизмов?


Известно, что ген C9ORF72 входят в группу генов – участников развития различных нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амниотрофический склероз, лобно-височная деменция и другие. Еще в 2013 году было опубликовано исследование, в котором упоминалось, что к массовой гибели нейронов причастны дипепетидные повторы, имеющие склонность к агрегации (aggregation-prone dipeptide repeats (DPRs)). В последних трех работах, о которых пойдет речь далее, было показано, что такие DPRs образуются в результате неканонической трансляции, не требующей для инициации традиционного старт-кодона AUG. Новый механизм ученые назвали RAN (repeat-associated non-AUG) трансляцией.

В первым исследовании, проведенном учеными из Массачусетской больницы общего профиля в Бостоне (США) и национального центра научных исследований (НЦНИ) Франции, для изучения механизмов RAN-трансляции использовались лизаты кроличьих ретикулоцитов. Такая бесклеточная экспрессирующая система является частым инструментов для изучения трансляции белка, так как ретикулоциты содержат все компоненты для трансляции белков, но не имеют ядра. Это позволяет экспериментатору лучше контролировать условия и наиболее четко отслеживать синтез белка in vitro. Исследователи сконструировали ДНК, содержащие мотив из 66 повторов GGGGCC, расположенный за 113 п.н. до первого интрона гена C9ORF72. При этом на протяжении всего 113-нуклеотидного участка не встречалось ни одного старт-кодона (AUG). Кроме того, в конце мотива были добавлены три последовательности, кодирующие короткие белковые метки или тэги, которые после транскрипции и трансляции оказывались «привязаны» к основному белковому продукту. Причем, эти три короткие последовательности были встроены таким образом, что каждая прочитывалась в своей рамке считывания (+1, +2 и +3 соответственно). Этот «экспериментальный трюк» давал возможность ученым отслеживать, с какой именно рамки считывания идет трансляция DPRs. В результате было показано, что в ходе трансляции образуются три вида полипептидов, образованных DPRs: поли-глицин-аланин, поли-глицин-аргинин и поли-глицин-пролин, что говорит о прохождении трансляции по всем трем рамкам считывания. Однако ученые отметили, что по первой рамке считывания трансляция проходит наиболее эффективно и дает больший выход соответствующего белкового продукта – поли-глицин-аланина. Самое интересное, что исследователям удалось установить, что независимо от того, в какой рамке считывания начинается процесс синтеза белка, инициация трансляции происходит с кодона CUG. Для того, чтобы переключиться на другую рамку считывания, рибосома пропускает один или два нуклеотида, после чего процесс трансляции возобновляется. В остальном, по словам ученых, процесс RAN-трансляции не отличался от классического для его реализации были задействованы белки, связывающиеся с КЭП-структурой, инициаторная тРНК была загружена метионином, несмотря на другую последовательность старт-кодона.

Второе исследование, проведенное под руководством Питера Тодда из Мичиганского университета (США), подтвердило, что RAN-трансляция начинается с CUG-кодона в эксперименте на клеточных моделях. Изучая механизмы клеточного интегрированного стресс-ответа, ученые показали, что под воздействием стресса в клетке инициируется фосфорилирование фактора элонгации трансляции eIF2a, в результате чего происходят ингибирование трансляции и остановки синтеза «привычных» для клетки белков. Однако в отношении механизмов неканонической трансляции, к которым относится RAN-трансляция, фосфорилированная форма eIF2a способна выступать в качестве триггера, повышая экспрессию DPRs. Более того, по словам ученых, в условиях стресса в клетке формируется положительная обратная связь: фосфорилированный eIF2a способствует усилению RAN-трансляции, тогда как образовавшиеся в ходе этого процесса DPRs участвуют в формировании стрессовых гранул (скопления рибонуклеопритеидов в цитоплазме, наблюдающиеся после воздействия стрессовых факторов, например, теплового шока или окислительного стресса), что, в свою очередь, ведет к еще более сильному ингибированию синтеза нормальных белков по классическому пути. Необходимо отметить, что еще ранее исследователями было замечено скопление стрессовых гранул в клетках мозга, полученных от больных боковым амниотрофическим склерозом, а также лобно-височной деменцией.

Влияние стресса на усиление экспрессии DPRs было также подтверждено работой ученых из университета Джона Хопкинса (Балтимор, США). Кроме того, в своей публикации, вопреки предыдущим исследованиям, авторы показывают, что наряду с КЭП-зависимой RAN-трансляцией существует также КЭП-независимая трансляция, проходящая, однако, на 20-30% менее эффективно по сравнению с первой. Для изучения механизмов трансляции по КЭП-зависимому и КЭП-независимому путям использовалась специальная бицистронная конструкция, позволяющая сравнивать эффективности двух процессов. Ученые отметили, что фосфорилирование eIF2a вызывает накопление в цитоплазме белка TDP-43, ассоциированного с развитием нескольких нейродегенеративных заболеваний, который, в свою очередь, повышает эффективность КЭП-независимой трансляции.

Далее было проведено несколько экспериментов с усеченным первым интроном гена C9ORF72 (не содержащим КЭП структуру). Обычно подобные интронные последовательности вырезаются в ходе сплайсинга и образуют самостоятельные петлеобразные структуры, которые в норме разрушаются в ядре. Однако подобная структура, представленная повторами CCCCGG, выходила через ядерные поры в цитоплазму, где связывалась с рибосомным комплексом, инициируя синтез DPRs. Ученые предполагают, что вероятно КЭП-независимая трансляция становится возможной благодаря особой пространственной структуре сплайсированной РНК. По словам Вьюви Ченга – первого автора исследования – изучение механизмов КЭП-независимой трансляции является крайне необходимой задачей, так как в живом организме интронная РНК, лишенная КЭП-структуры, встречается гораздо чаще, чем интронная РНК, сохранившая КЭП. Последняя может образовываться лишь в результате абберантного сплайсинга. Таким образом, по мнению авторов, именно процесс КЭП-независимой трансляции может лежать в основе патологических изменений, сопровождающих нейродегенеративные заболевания.

Несмотря на некоторые противоречия, все три исследования четко подтверждают, что механизм RAN-трансляции, ведущий к образованию DPRs, вносит вклад в развитие огромного спектра заболеваний нервной системы. Поэтому необходимо сосредоточиться на поиске средств, позволяющих остановить «порочный круг», образующийся в клетке. На данный момент ученые предлагают использовать молекулярные ингибиторы киназ, отвечающих за фосфорилирование eIF2a. В качестве альтернативы рассматривается также применение коротких антисмысловых олигонуклеотидов, способных комплиментарно присоединяться к матричной РНК перед CCCCGG повторами и блокировать процесс RAN-трансляции.

Оригинал статьи

Еще

Еще

Записаться на генетическую Школу