Новая шестинуклеотидная искусственная ДНК опробована in vivo
Ученые добавили к генетическому коду две новые буквы: X и Y, создав полусинтетический организм, способный генерировать множество совершенно новых аминокислот.
Группа ученых под руководством Флойда Ромесберга из Исследовательского института Скриппса в Калифорнии впервые создала полусинтетический организм, содержащий наряду с естественными двумя парами азотистых оснований ДНК дополнительную, искусственную пару – X-Y. Исследователи интегрировали новые элементы в ДНК бактерий кишечной палочки (E.coli) и показали, что полученный организм способен не только к репликации искусственной ДНК, но и к синтезу аминокислоты, закодированной с помощью синтетических оснований.
Работа ученых базировалась на результатах их предыдущих исследований, в ходе которых была получена искусственная пара оснований: X (dNaM - дезоксирибометоксинафтил трифосфат) и Y (dTPT3 - дезоксириботиопиримидинтион-3 трифосфат). Примечательно, что в отличие от классических водородных связей, образующихся между «естественными» комплементарными основаниями, искусственные основания X и Y соединяются благодаря гидрофобным взаимодействиям.
Кроме того, исследователями была разработана система транспорта искусственных оснований в клетку. Для доставки X и Y, вносимых в ростовую среду, использовался мембранный транспортер нуклеотидтрифосфатов PtNTT2, выделенный из диатомовой водоросли Phaeodactylum tricornutum и способный переносить в клетку синтетические основания в форме трифосфатов.
Искусственная пара оснований была встроена в одну из плазмид E.coli, а для того, чтобы в ходе деления бактерии не элиминировали рекомбинантную плазмиду, использовалась известная система направленной рестрикции CRISPR/Cas9, с помощью которой ДНК, утратившая искусственную пару оснований, разрушалась рестриктазой Cas9.
Основываясь на полученном заделе, в ходе текущей работы ученые попытались адаптировать трансляционный аппарат клетки к синтетическим молекулам. Чтобы продемонстрировать способность полусинтетической ДНК кодировать информацию, ученые ввели искусственное основание в ген зеленого флуоресцентного белка sfGFP (superfolder green fluorescent protein). Тирозин (TAC) в позиции 151 был заменен на серин (AGC), но вместо гуанина в ген встроили синтетическое основание X, получив в результате триплет – AХC. Замену тирозина серином ученые объяснили наиболее широкой специфичностью его аминоацил-тРНК-синтетазы (фермента, осуществляющего присоединение аминокислоты к молекуле тРНК). Чтобы обеспечить соответствие кодон-антикодон, в ген для тРНК серина ввели последовательность GYT. Для обеспечения транскрипции мРНК гена GFP и тРНК серина с ДНК-матрицы использовалась РНК-полимераза бактериофага T7, известная своей способностью к транскрипции синтетических нуклеотидов in vivo. Для того, чтобы оценить, насколько точно клеточный аппарат справился с синтезом белка sfGFP на матрице мРНК, содержащей искусственный нуклеотид, был проведен анализ выделенного sfGFP с помощью жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии. Анализ показал, что в 98,5% случаев в 151 позиции белка sfGFP находилась аминокислота-серин.
На втором этапе исследования ученые присваивали искусственному кодону отдельные, неканонические аминокислоты (не входящие в 20 «основных» протеиногенных α-аминокислот, кодируемых универсальным генетическим кодом). Для эксперимента были выбраны пирролизин и пара-азидофенилаланин. При этом в геном E.coli были дополнительно введены специфические для данных аминокислот гены тРНК и соответствующей аминоацил-тРНК-синтетазы.
В параллельном эксперименте вместо искусственного кодона неканоническим аминокислотам присваивали амбер-кодон (терминирующий кодон - TAG) и использовали специально сконструированную супрессорную тРНК, способную включать в растущую полипептидную цепь соответствующую аминокислоту (пирролизин либо пара-азидофенилаланин) в ответ на амбер-кодон (метод амбер-супрессии).
В результате было показано, что бактерии успешно делились, продолжая синтезировать рекомбинантный sfGFP. Анализ интенсивности свечения полученных штаммов показал, что свечение полусинтетических клеток E.coli достигло почти 70 процентов от свечения клеток с «натуральным» белком (в случае включения пара-азидофенилаланина). Кроме того, исследователи отметили более высокий процент содержания рекомбинантного sfGFP в случае, когда неканонические аминокислоты были закодированы с помощью искусственного кодона, по сравнению с использованием метода амбер-супрессии.