31 января 2018

Новый метод тройного мечения ДНК проливает свет на судьбу делящихся стволовых клеток

Как происходит нейрогенез? В какой момент стволовые клетки начинают дифференцироваться? На эти и другие вопросы поможет ответить новый способ тройного мечения реплицирующейся ДНК, позволяющий наблюдать за делением и дифференциацией стволовых клеток практически в любых тканях


Над созданием метода, описанного в публикации журнала Stem Cell Reports, трудился коллектив российских исследователей из института биологии развития им. Кольцова РАН (часть работы проходила на базе Курчатовского института) совместно с учеными из университета Стоуни-Брук (США) и лаборатории Колд Спринг Харбор (США). Новый способ позволяет помечать делящиеся стволовые клетки сразу тремя разными метками.

Стволовые клетки, в отличие от большинства дифференцированных клеток тканей, постоянно делятся. Для того, чтобы узнать, сколько делений проходят стволовые клетки в той или иной ткани, какова длина клеточного цикла, куда перемещаются клетки сразу после деления и как проходит их дифференцировка, удобнее всего отслеживать накопление новых молекул ДНК, которые образуются в ходе репликации в S-фазе клеточного цикла. В середине XX века для этого начали использовать радиоактивно меченный тимидин. Так как синтез новых цепей ДНК происходит в S-фазе клеточного цикла, в момент введения тимидина помечаются только те клетки, которые в это время проходят S-фазу. Попав в клетку и встроившись в дочернюю молекулу ДНК в ходе ее удвоения, меченый нуклеотид будет передаваться дочерним клеткам, что позволит отслеживать интересующие клеточные события во времени.

Изначально, когда в арсенале исследователей была только одна метка (радиоактивно меченный тимидин), эксперимент по наблюдению за клеточными популяциями требовал использования большого количества животных. Более того, чтобы проследить за этапами дифференцировки клеток какой-либо ткани, приходилось детектировать каждый этап в организме нового животного. Например, ткань кишечника первой группы мышей анализируется через 2 часа после ввода метки, вторую группу берут на анализ через 24 часа и т.д. Такой способ позволяет увидеть, как перемещались меченые клетки во времени, однако из-за смены модельного организма на каждом этапе эксперимента точность исследования снижается.

Если же использовать несколько разных меток, то можно водить их в одно животное в разные промежутки времени. В начале 90-х годов прошлого века исследователи разработали ряд галогенированных аналогов тимидина, которые можно детектировать при помощи антител. Это позволило использовать две разных метки в эксперименте на одном организме и значительно расширить возможности наблюдений. Так, было проведено несколько исследований по определению времени, за которое клетка способно повторно вступить в клеточный цикл после длительной фазы покоя, а также по анализу факторов, способствующих активации «спящих» клеток, и т.д.

С появлением и распространением методов клик-химии появился новый способ мечения нуклеотидов – при помощи химического присоединения флуоресцентного красителя. Однако при одновременном использовании этого красителя и моноклональных антител для детекции меченых нуклеотидов возникает проблема так называемого неспецифического связывания. Дело в том, что при тройном маркировании ДНК "непрокрашенные" участки, то есть те модифицированные нуклеотиды, к которым не присоединился флуоресцентный краситель, связываются моноклональными антителами, специфичными к другим меткам (галогенированным аналогам тимидина), тем самым искажая результат эксперимента. В текущей работе исследовали нашли способ блокировать "непрокрашенные" участки, добавив в методику дополнительную стадию обработки клеток родственным красителю, но бесцветным азидометилфенилсульфидом. После проведения такой обработки клетки инкубировали с моноклональными антителами против галогенированных нуклеотидов. Благодаря предварительному введению блокирующего вещества авторам удалось избавиться от неспецифичного связывания флуоресцентного красителя с антителами, что значительно увеличило разрешение и точность метода.

Кроме того, в своей работе исследователи предложили использовать дополнительную четвертую метку в качестве вспомогательного маркера активно пролиферирующих клеток – ядерный антиген Ki67, детектируемый также с помощью специфичных моноклональных антител. Экспрессия Кi-67 позволяет выделить клетки, находящиеся в активной фазе клеточного цикла, на всём его протяжении (G1-, S-, G2- и M-фазы).

При помощи нового метода авторы наблюдали за субпопуляциями стволовых клеток в тканях мозга, кишечника и семенников лабораторных мышей. На клетках кишечника ученым удалось продемонстрировать, что метки, введённые в разное время, распределились в соответствии с известными данными об их перемещении. Анализ срезов мозга, в которых происходит нейрогенез, в частности зон гиппокампа и желудочков, после тройного мечения (метки вводили в мозг живым мышам с интервалом в два часа) позволил определить такие параметры клеточного цикла, как продолжительность S-фазы.

По словам исследователей, на данный момент одной из главных областей применения метода тройного мечения является исследование влияния различных препаратов (например, лекарств, применяемых для лечения болезни Альцгеймера, либо противоопухолевых препаратов) на процессы нейрогенеза у мышей.

Оригинал статьи

Записаться на генетическую Школу