Опубликованы результаты новых экспериментов по редактированию человеческих эмбрионов
В США испытали технологию CRISPR/Cas9 в качестве средства для борьбы с наследственным заболеванием сердца
Американские ученые из Орегонского университета провели редактирование человеческого эмбриона при помощи технологии CRISPR/Cas9. В качестве объекта для редактирования был выбран ген MYBPC3, несущий четырехнуклеотидную делецию. Известно, что мутации в этом гене ведут к развитию гипертрофической кардиомиопатии.
Метод, который использовали исследователи, основывается на целенаправленном внесении в нужный участок ДНК (несущий мутацию) двухцепочечного разрыва и последующем его восстановлении в «правильном» варианте (без мутации). Разрыв осуществляется при помощи нуклеазы Cas9, которая направляется к нужному месту при помощи «гидовой» РНК. Репарация же разрыва может осуществляться по нескольким механизмам, основными из которых являются: NHEJ (Non-homologous end joining) – соединение «разорванных концов», при котором, как правило, вносятся еще большие мутации, и HDR (homology directed repair) – репарация разрыва на основе гомологичной матрицы, позволяющей точно восстановить функциональную последовательность ДНК. Для включения нужного для исправления мутации механизма HDR исследователи обычно вносят дополнительную «донорную» одноцепочечную ДНК, обладающую гомологией с ДНК, в которую будет внесен разрыв. «Донорная» ДНК служит матрицей для репарации по механизму HDR. Все три компонента: нуклеаза Cas9, «гидовая» РНК и «донорная» ДНК и являются главными инструментами редактирования генома по технологии CRISPR/Cas9.
Ученые сообщают, что в результате эксперимента из 58 опытных эмбрионов нормальным генотипом обладали 42, то есть 72,4%. Однако такой высокий процент обусловлен отчасти природой выбранного в качестве модели заболевания. В работе авторов использовались гетерозиготные эмбрионы, полученные при искусственном оплодотворении яйцеклеток здоровых женщин спермой донора, больного гипертрофической кардиомиопатией. Так как указанное заболевание является доминантным, то в соответствие с законами Менделя, половина эмбрионов будет иметь изначально нормальный генотип. Поэтому, можно сказать, что при помощи CRISPR/Cas9 исследователи отредактировали генотип только у половины из оставшихся эмбрионов с мутацией.
Тем не менее, в работе по редактированию генов человеческого эмбриона, проведенной китайскими учеными в 2015 году, успешный результат был достигнут только в 7,4% случаев. Кроме того, эксперимент 2015 года описывает большое количество неспецифических разрывов или так называемых “off target” эффектов, то есть двухцепочечных разрывов, внесенных не в нужный участок ДНК. Также китайские ученые столкнулись с мозаицизмом у отредактированных эмбрионов, который заключался в том, что у части клеток эмбриона мутация была устранена, тогда как остальные клетки сохраняли патогенную мутацию.
В новой работе американские исследователи попытались учесть описанные сложности и применили два новых экспериментальных подхода, позволяющих избежать «побочных эффектов» технологии.
Для уменьшения количества неспецифических разрывов ученые вводили в клетки нуклеазу Cas9 непосредственно в виде белка вместо стандартно используемой плазмиды, кодирующей последовательность Cas9. Это позволило сократить «время жизни» нуклеазы в клетке, а также лимитировать ее количество, так как белок Cas9 уже не мог непрерывно синтезироваться из-за отсутствия кодирующей его ДНК. Такой подход принес положительные результаты – секвенирование предполагаемых сайтов, по которым могла произойти незапланированная рестрикция, подтвердило полное отсутствие подобных эффектов.
Проблема мозаицизма у отредактированных эмбрионов была решена не сразу. Сначала авторы проводили редактирование оплодотворенных зигот, и среди полученных эмбрионов непременно присутствовал определенный процент мозаиков. Тогда исследователи решили объединить процесс оплодотворения яйцеклетки с введением компонентов системы CRISPR/Cas9. В результате количество мозаиков сократилось до 1.
Также в ходе анализа результатов эксперимента ученые обнаружили, что «донорная» ДНК, применяемая в качестве матрицы для HDR, не использовалась клеткой в процессе репарации. В эмбрионах с исправленными мутациями HDR осуществлялась за счет «здоровой» копии гена, полученной от яйцеклетки. Этот вывод ограничивает возможности применения технологии CRISPR/Cas9 лечением только доминантных заболеваний. Тем не менее, по словам ученых, необходимы дополнительные исследования, направленные на более глубокое изучение специфических систем репарации, существующих в зиготе.
Для изучения дальнейшей выживаемости эмбрионов исследователи культивировали 22 эмбриона, подвергнутых редактированию. В результате 11 эмбрионов достигли стадии бластоцисты, после чего были уничтожены по этическим соображениям.
Этическая сторона эксперимента сама по себе заслуживает отдельных обсуждений, так как в США, как и во многих других странах, формально запрещены государственные научные программы по редактированию человеческих эмбрионов. Однако, ученые оговаривают, что их работа была финансирована средствами частных компаний. Кроме того, как уже упоминалось выше, в Китае вообще нет подобных запретов, и первые исследования с использованием эмбрионов человека были развернуты еще до проведения Международного саммита по геномному редактированию в Вашингтоне.