Получены синтетические человеческие прионы
Прионные болезни — это группа заболеваний человека и животных, при которых происходит гибель нервных клеток головного мозга за счет накопления патологического белка (приона). Белковые комплексы сначала накапливаются внутри клетки, а потом высвобождаются во внеклеточное пространство, где формируют «амилоидные бляшки». На сегодняшний день к прионным заболеваниям относят болезнь куру и ятрогенную болезнь Крейтцфельда-Якоба, которые передаются как инфекции, наследственные болезни: синдром Герстманна-Штреуслера-Шайнкера и фатальную семейную инсомнию, а также спорадическую форму болезни Крейтцфельда-Якоба (именно этой формой страдает более 90% больных). Известно, что прионный белок контагиозен независимо от происхождения. Что же представляет собой прион?
Инфекционный прион является сиалогликопротеидом, сходным по строению с амилоидом, накопление которого в клетках и тканях организма ведет к амилоидозу. У возбудителя нет нуклеиновой кислоты, то есть генетического материала, необходимого для репродукции. В связи с этим прионы чрезвычайно устойчивы к большинству традиционных способов дезинфекции, губительных для вирусов и микроорганизмов.
Большинство антимикробных средств не влияют на инфекционность прионов, а отсутствие эффективного иммунного ответа организма человека и животных на его введение не позволяет в настоящее время создать вакцины и сыворотки.
Известно, что в человеческом организме существует белок PrPC, являющийся продуктом гена PRNP на коротком плече 20 хромосомы, соответствующий прионному белку по массе и аминокислотной последовательности. Есть данные, что PrPC играет важную роль в прикреплении клеток, передаче внутриклеточных сигналов, а потому может быть вовлечён в коммуникацию клеток мозга, однако функции PrPС исследованы недостаточно. Различие между PrPС и его инфекционной прионной формой, названной PrPSc, лежат в строении третичной стуктуры. На данный момент ясно только то, что третичная структура PrPС состоит из трёх α-спиралей и двухцепочечного антипараллельного β-листа, тогда как в структуре PrPSc вместо α-спиралей преобладают β-слои.
Считается, что процесс перехода нормального белка в инфекционную форму представляет собой что-то вроде цепной реакции. Полагают, что 1 молекула нормального белка PrPC соединяется с 1 молекулой попавшего во внутреннюю среду организма приона PrPSc. Они образуют гетеродимерный промежуточный продукт, который трансформируется в 2 молекулы PrPSc. В последующих циклах продолжается экспоненциальный рост числа прионов. Они значительно обогащены пролином и глицином, поддерживающим в полипептидной цепи жесткую бета-структуру, которая определяет способность прионов к образованию внутриклеточных включений, морфологически проявляющихся типичным амилоидом. Синтез приона сопровождается накоплением белка в клетке и неконтролируемой трансляцией матричной РНК, кодирующей клеточный PrPSc. Такой механизм синтеза и накопления белка, вызывающего накопление внутриклеточных включений типа амилоида, не противоречит основным законам генетики и хорошо объясняет патогенез заболевания, а главное, длительность инкубационного периода. В данном случае отсутствует эффект «репликативного взрыва», свойственного большинству вирусных инфекций.
К настоящему времени обнаружено 15 мутаций в гене PRNP, достоверно связанных с наследственными прионными заболеваниями. Все эти мутации предположительно вызывают конформационные превращения РrРС белка. При спорадической болезни Крейтцфельда-Якоба не было обнаружено специфических мутаций РrРС, однако полиморфизм в кодоне 129, кодирующем метионин и валин, может влиять на восприимчивость к инфекционным прионовым болезням.
Разнообразие проявлений прионных заболеваний говорит о том, что существуют несколько линий прионов, вызывающих различные патоморфологические картины заболеваний. В соответствии с классификацией P. Parchi выделяют 6 генетических подтипов прионов (MM1, MM2, MV1, MV2, VV1, VV2).
В настоящий момент предложены две гипотезы, объясняющие существование нескольких линий прионов. Первая утверждает, что соответствующая специфическая для данной линии приона информация кодируется третичной и четвертичной структурами PrPSc. Вторая гипотеза предполагает, что различие прионов происходит из гликоформ PrPSc. Эта гипотеза более привлекательна, так как различий PrPSc гликоформ достаточно для объяснения большого числа линий прионов.
Одно из главных затруднений, с которым сталкиваются ученые, изучающие прионы, заключается в том, что искусственно полученные прионы, как правило, теряют свою инфективность. В статье, опубликованной в журнале Nature Communications, группе ученых из частного исследовательского университета в Кливленде удалось получить два типа прионных белков (MM1 и MM2 подтипов), которые оказались способны вызывать инфекцию у мышей.
В прошлых работах авторы уже получали рекомбинантный белок PrPSc с помощью бактерий, культивируемых в присутствии человеческого белка sCJD (Creutzfeldt-Jakob disease), выделенного из мозга умерших. Однако, такие рекомбинантные прионы не были способны вызвать инфекцию in vivo. Исследуя причину данного феномена более глубоко, исследователи пришли к выводу, что патогенность приона определяется минимальными конформационными отличиями в С-концевом домене, возникающими в ходе посттрансляционных модификаций белка.
Для детекции прионной формы белка PrPSc ученые использовали метод QuIC (quaking-induced conversion). QuIC представляет собой «белковый» аналог ПЦР (без использования нуклеотидов), используемый для амплификации аминокислотных последовательностей. В результате многократно повторенного циклического процесса достигается амплификация PrPSc в 109 раз. Амплифицированный комплекс детектируют при помощи специфического красителя – тиофлавина Т. Как и в предыдущих экспериментах, ученые получали рекомбинантный PrPSc в бактериальных культурах, однако при культивировании в тандеме с MM1 и MM2 прионами использовались дополнительные молекулярное кофакторы - моносиалоганглиозид (GM1) и пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (ПОФХ) соответственно. В качестве модели для оценки инфективности синтетических прионов были выбраны трансгенные мыши, экспрессирующие человеческий гликозилированный PrP, то есть обладающий нативной посттрансляционной модификацией. В результате экспериментов было показано, что рекомбинантные прионы были способны вызывать клинические симптомы поражения нервной ткани у мышей, причем клиническая картина при заражении прионами, полученными от MM1 и MM2, различалась. Более того, прионы, выделенные из бактериальной культуры после первого пассажа, обладали достаточно слабой инфективностью, тогда как после заражения прионами второго пассажа инкубационный период сокращался почти вдвое.
Полученные результаты говорят в пользу того, что процесс потери физиологической структуры РrРС и запуск «цепной реакции» формирования аномальной формы PrPSc может управляться с помощью различных кофакторов, причем именно кофактор влияет на то, какую именно патологическую прионную форму примет РrРС и, соответственно, какие нервные ткани будут поражены в первую очередь.
Авторы отмечают, что описанные ими кофакторы могут были далеко не единственными молекулами, способными влиять на конверсию прионных белков и формирование новых линий. Дальнейшие исследования могут выявить новые молекулярные факторы, способные блокировать репликацию прионов и таким образом замедлять или даже останавливать развитие тяжелых заболеваний.