Технология eMAGE – точный генетический «скальпель» или альтернатива системы CRISPR/Cas9
Ученые Йельского университета сообщили о создании нового способа редактирования генома. Эффективность метода сравнима с работой хирургического скальпеля
Известные на сегодняшний день технологии редактирования генома, такие как цинковые пальцы (ZFNs), нуклеазы TALENs, а также популярная модифицированная бактериальная система CRISPR/Cas9, основываются на том, что для внесения изменений в гены сначала провоцируется двухцепочеченый разрыв ДНК. Однако в ситуациях, когда необходимо произвести замену одной или нескольких пар нуклеотидов ДНК одновременно по многим сайтам, применение этих технологий ограничено.
Дело в том, что множественная рестрикция ДНК вызывает гибель клеток, причем цитотоксичность этого процесса растет с увеличением количества целевых сайтов для рестрикции. Однако при использовании системы CRISPR-Cas9 для нетипичных сайтов ДНК (например, промоторные последовательности гена) возникает проблема повторного разрезания уже «отредактированной» ДНК нуклеазой Cas9 всилу невозможности после внесения направленной мутации на этих участках использовать стандартные методы «маскировки» целевых сайтов от узнавания гидовой РНК.
Команда ученых из Йельского университета разработала способ внесения новой генетической информации в клетку без многочисленных разрывов двойной спирали.
В основу работы ученых легли эксперименты на кишечной палочке, в которых была успешно протестирована возможность внесения направленных хромосомных модификаций с помощью искусственных одноцепочечных олигонуклеотидов (single-stranded DNA (ssDNA) oligodeoxynucleotides - ssODNs), комплиментарных «отстающей» цепи, формирующей репликативную вилку в ходе естественного процесса репликации ДНК. Такой метод модификации генома был назван многократным генным редактированием (multiplex automated genome engineering MAGE). Авторам данной работы удалось адаптировать метод для эукариотических клеток. Эта технология была названа eMAGE (eukaryotic MAGE). Исследователи подчеркивают, что эффективность eMAGE не зависит от работы белка Rad51, управляющего процессом гомологичной рекомбинации, так как eMAGE основывается на других молекулярных механизмах. Кроме того, eMAGE позволяет вносить в геном очень точные изменения (с «разрешением» до одной пары нуклеотидов), избегая при этом нежелательных мутаций, возникающих вследствие множественных двухцепочечных разрывов. Точность редактирования генома с помощью eMAGE составляет более 40 %.
Эксперименты проводили на дрожжах-сахаромицетах. В качестве «мишеней» для геномного редактирования были выбраны промоторные, терминаторные и структурные участки 4 генов, отвечающих за биосинтез бета-каротина из фарнезилпирофосфата. Для этого было сконструировано 74 одноцепочечных олигонуклеотида, кодирующих 482 точечные мутации для таргетирования вышеупомянутых генов, находящихся на 4 различных хромосомах. При использовании данного метода, за один акт трансформации было детектировано включение 12 ssODNs и инициировано 60 направленных мутаций в ДНК по целевым сайтам.
Для встраивания бо´льшего количества ssODNs по таргетным сайтам исследователи разработали циклическую схему трансформаций дрожжевых клеток, основанную на позитивно-негативной селекции с помощью маркерного гена URA3, который был заранее встроен в последовательность гена перед таргетными сайтами. Необходимо отметить, что ген URA3 отвечает за экспрессию белка URA3p, который конвертирует 5-фтор-оротовую кислоту (5-FOA), нетоксичную для клеток, в токсичный для них 5-фтор-урацил. Поэтому при добавлении в ростовую среду 5-FOA клетки, несущие функционирующий ген URA3, будут гибнуть. Кроме того, URA3 кодирует оротодин-5'-фосфатдекарбоксилазу, которая катализирует синтез уридина, и при инактивации гена URA3 дрожжевые клетки способны расти только на селективной среде с добавлением урацила.
Возвращаясь к схеме циклической трансформации, разработанной учеными, отметим, что в эксперименте все циклы трансформации были разделены на четные и нечетные. При этом в нечетных циклах вместе с основным пулом ssODNs дрожжевые клетки также трансформировали олигонуклеотидом, направленным на ген URA3. Этот «маркерный» олигонуклеотид содержал мутацию, блокирующую работу URA3 при его внедрении в последовательность гена. По завершении трансформации проводился отбор живых клеток на среде с добавлением 5-FOA. Таким образом, после первого (нечетного) цикла сохранялись только клетки, несущие инактивированный ген URA3, а значит содержащие в своем геноме ssODNs. На втором (четном) цикле трансформации вместе с основным пулом ssODNs вводился «маркерный» олигонуклеотид для четных циклов, который при встраивании в ген URA3 восстанавливал его работу. После завершения четного цикла дрожжевые клетки селецировали на ростовой среде с добавлением урацила, что позволяло отделить клетки с функционирующим геном URA3, а значит, дважды прошедшие трансформацию успешно.
Такой механизм позволил ученым провести многократные трансформации дрожжевых клеток пулом искусственно синтезированных олигонуклеотидов, увеличивая количество внесенных мутаций с каждым циклом.
В результате проведенного эксперимента было получено более 105 различных комбинаций генов, участвующих в биосинтезе бета-каротина. Для того, чтобы достичь подобного генетического разнообразия с использованием технологии CRISPR/Cas9, пришлось бы произвести более 40 двухцепочечных разрывов. При этом еще два года назад в нескольких исследованиях было показано, что летальное количество двухцепочечных разрывов в клетке начинается от четырех.
Авторы исследования полагают, что разработанный ими метод, с помощью которого можно генерировать большое разнообразие нуклеотидных вариантов в выбранном участке гена, может найти широкое применение в биотехнологии. Так, для повышения гетерологичной экспрессии белков в настоящее время применяется в основном замена естественного промотора на более сильный. Используя различные библиотеки промоторов, можно сконструировать около 100 различных генетических кассет для экспрессии нужного белка. Технология eMAGE дает возможность вносить множественные точечные изменения во все регуляторные элементы генетического аппарата, отвечающего за биосинтез желаемого белка, и тем самым позволяет получить до 100 000 разнообразных вариантов.