27 февраля 2018

Ученые нашли очередное применение бактериальным системам CRISPR

Американские исследователи разработали новую диагностическую систему на основе CRISPR-Cas12a. Новый подход позволяет эффективно детектировать ДНК папилломавируса человека


Cas12a – ДНК нуклеаза бактериальной системы CRISPR (второе название Cpf1) – была открыта в 2015 году. Белок Cas12a относится к нуклеазам V типа, тогда как широко используемая сегодня Cas9 принадлежит ко II типу нуклеаз, что подразумевает некоторые отличия в их строении и способах «работы».

Первым отличием является то, что белок Cas9 содержит два нуклеазных домена (HNH и RuvC), один из которых разрезает нить ДНК, комплементарную гидовой РНК (небольшая по размеру молекула РНК, обеспечивающая специфичность процесса рестрикции ДНК нуклеазой за счёт комплементарности участку разрезаемой последовательности), тогда как другой домен разрезает противоположную нить. Cas12a, в свою очередь, также способна осуществлять двухцепочечный разрыв, однако при этом используется только домен RuvC.

Вторым отличием Cas12a является ее способность к рестрикции таких двухцепочечных участков ДНК, которые не может разрезать Cas9. Это обусловлено другим «составом» последовательности PAM (protospacer adjacent motif ), располагающейся рядом с местом разрыва. PAM для Cas12a представляет собой АТ-богатый участок ДНК, тогда как Cas9 «работает» с последовательностью PAM: 5'-NGG-3'.

И наконец, после разрезания ДНК белок Cas12a оставляет «липкие» 5'- нависающие концы, тогда как в результате рестрикции нуклеазой Cas9 концы получаются тупые.

Группа ученых из Калифорнийского университета в Беркли (США) под руководством доктора Дженифер Дудни решила глубже изучить особенности работы нуклеаз Cas12a. В своем исследовании авторы использовали белок Cas12a, выделенный из клостридий Lachnospiraceae - LbCas12a.

Первые эксперименты по изучению нуклеазной активности LbCas12a были проведены с геномом фага М13. В качестве контроля использовалась известная нуклеаза Cas9. Было показано, что фаговая ДНК под действием LbCas12a была повреждена практически полностью за очень короткий промежуток времени. Это наблюдение дало основание предположить, что рестрикция носит неспецифический характер. Предположение подтвердилось, когда исследователи повторили эксперимент, добавив в реакционную среду вместо гидовой РНК, комплементарной последовательности генома М13, другую гидовую РНК, комплементарную ДНК-активатору, который был также внесен в реакцию. ДНК-активатор представлял собой короткую последовательность ДНК, не имеющую гомологичных участков в геноме фага. В результате было показано, что наряду с рестрикцией ДНК-активатора разрезанию также подверглась и фаговая ДНК.

Используя метод мечения точечным флуорофором (fluorophore quencher (FQ)-labeled reporter assay), исследователи установили, что нуклеаза LbCas12a обладает способностью к неспецифической транс-рестрикции одноцепочечной ДНК (nonspecific ssDNA trans-cleavage). Причем эта способность проявляется у нуклеазы только в том случае, когда она была предварительно активирована сайт-специфическим связыванием двухцепочечной ДНК с гидовой РНК. То есть для LbCas12a необходимо, чтобы сначала гидовая РНК комплементарно связалась с двухцепочечной ДНК (важно, что сам процесс последующей сайт-специфической рестрикции уже не является обязательным условием активации), после чего нуклеаза приобретает способность к неспецифическому разрезанию других одноцепочечных молекул ДНК, присутствующих в реакционной среде.

Подобная неспецифическая транс-рестрикционная активность была также обнаружена у Cas12a белков V типа, выделенных из других микроорганизмов (Acidaminococcus sp. (AsCas12a), Francisella novicida (FnCas12a), Alicyclobacillus acidoterrestris (AaCas12b)). Исследователи подчеркнули, что ни одна нуклеаза CRISPR-Cas9 II типа не обладает такой способностью.

Полученные результаты позволили ученым разработать систему детекции ДНК, основанную на описанной неспецифической транс-рестрикционной активности Cas12a.

Объектом эксперимента стал вирус папилломы человека 16 и 18 типа (human papillomavirus HPV16 и HPV18). В качестве таргетной последовательности был выбран достаточно консервативный участок вирусного генома (различающийся у разных типов вирусов не более чем на 6 нуклеотидов), расположенный вблизи PAM. Для эксперимента были сконструированы соответствующие комплементарные гидовые РНК, а также короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, меченные флуорофором. Сигнал от флуорофора детектировался в случае разрезания нуклеазой олигонуклеотида, которое, в свою очередь, происходило только в случае предварительного связывания гидовой РНК с таргетной ДНК вируса. Кроме того, авторы совместили рестрикцию нуклеазой Cas12a с рекомбиназной полимеразной амплификацией для повышения точности и чувствительности метода, назвав новый подход – DETECTR.

Система DETECTR проверялась на ДНК, выделенной из разных человеческих клеточных линий, предварительно инфицированных папилломавирусами. Эксперимент показал, что метод DETECTR позволяет обнаруживать вирусную ДНК в аттомолярных концентрациях (10-18 моль/л). Далее с помощью DETECTR были проанализированы анальные мазки 25 пациентов, больных папилломавирусом. Предварительно эти образцы тестировали с помощью стандартного метода обнаружения HPV16 и HPV18, основанного на ПЦР. Благодаря DETECTR всего за один час в 100% образцов была обнаружена ДНК папилломавируса 16-го типа и в 92% образцов – ДНК HPV18, что коррелировало с полученными ранее результатами ПЦР-анализа.

По словам авторов, система DETECTR по сравнению с другими современными методами значительно проще в использовании и не требует специализированного оборудования. Это позволит применять новый метод в клиниках с ограниченными ресурсами. Кроме того, необходимо дальнейшее изучение возможностей данного метода. Вполне вероятно, что в ближайшее время ученым удастся адаптировать его для других типов вирусных или бактериальных инфекций и даже для маркеров рака и хромосомных аномалий.

Оригинал статьи

Записаться на генетическую Школу