Ученые обнаружили четырехцепочечную ДНК in vivo
Какие еще формы может принимать ДНК кроме привычной двухцепочечной спирали?
Известно, что в условиях in vitro молекула ДНК способна формировать неканонические структуры, отличные от B-формы (наиболее часто встречаемая in vivo конформация ДНК, в которой 2 нити образуют правозакрученную спиральную структуру). К таким структурам относятся, например, G-квадродуплексы, образующиеся в гуанин-богатых регионах. Секвенирование данных областей показало, что G-квадродуплексы чаще всего формируются на регуляторных участках. В нескольких работах было показано, что G-квадродуплексы могут существовать и в условиях in vivo, участвуя в регуляции некоторых клеточных путей.
I-мотив является еще одной неканонической четырехцепочечной формой ДНК, образующейся на ее G/C-богатых участках из нескольких интерклированных друг в друга полупротонированных цитозиновых оснований, принадлежащих как одной молекуле ДНК (интермолекулярная структура), так разным молекулам ДНК (межмолекулярная структура). При in vitro получении i-мотивов из цитозин-богатых участков ДНК (таких как теломеры, центромеры, промоторные области прото-онкогенов) было показано, что эти формы ДНК наиболее стабильны в слабокислом растворе. Этот факт давал многим ученым повод предполагать, что из-за несоответствия оптимального для i-мотивов pH внутриклеточному эти формы ДНК вообще не могут образовываться in vivo. Однако в ряде статей, вышедших в прошлом году, сообщалось о возможности формирования i-мотивов при физиологическом pH на левозакрученной ДНК в условиях тесного молекулярного взаимодействия.Ученые из австралийского Института медицинских исследований Гарвана получили специфические высокоаффинные антитела iMab, селективно связывающиеся с i-мотивами, что позволило окончательно подтвердить присутствие i-мотивов in vivo в человеческих клетках. Детекция связывания меченного красителем антитела iMab с последовательностью i-мотива проводилась с помощью стандартных иммунофлуоресцентных методов.
Так как i-мотивы и G-формы образуются на G/C-богатых регионах ДНК, которые в избытке присутствуют в теломерных областях человеческих хромосом, то исследователи начали поиск i-мотивов in vivo именно с этих участков. Для этого использовался метод двойного окрашивания человеческих клеток линии U2OS. Клетки одновременно окрашивали меченными красителем антителами iMab и меченными другим красителем антителами к белку TRF2 (регулятор длины теломер, локализуется преимущественно в теломерной области на хромосоме). В результате было показано, что большинство i-мотивов были действительно расположены на теломерах, однако существенное их количество наблюдалось и за пределами теломерных участков.
Аналогично исследователи проверили наличие i-мотивов в промоторных областях (в этом случае в паре с iMab использовали антитела против семейства транскрипционных факторов E12/E47, связывающихся с последовательностью регулятора экспрессии - Е-бокса (Enhancer Box)). Эксперимент выявил наличие конкуренции между двумя типами антител за центры связывания. Это, по словам авторов, может говорить об определенной роли i-мотивов в регуляции транскрипции.
Далее ученые задались вопросом, влияет ли стадия клеточного цикла на количество i-мотивов в ДНК. Для этого часть клеток человеческой линии HeLa были зафиксированы на границе G0/G1 фаз цикла, а часть – на границе G1/S. После окрашивания образцов iMab – антителами выяснилось, что активное формирование i-мотивов происходит в ходе G1 фазы клеточного цикла, когда клетка синтезирует большую часть мРНК и белков для последующего митотического деления. Данное наблюдение также говорит в пользу того, что i-мотивы, скорее всего, участвуют в транскрипции. Ученые предполагают, что i-мотивы могут служить своеобразной матрицей для присоединения транскрипционных факторов.
Интересно отметить также, что максимальное накопление G-квадродуплексов наблюдалось в S-фазу цикла, в момент минимального содержания i-мотивов. Это наталкивает на мысль, что данные формы ДНК являются антагонистами и, скорее всего, играют противоположные роли в регуляции генной экспресии.
Для определения влияния pH на количество i-мотивов в клеточных ядрах исследователи культивировали клеточные линии HEK 293T при различных концентрациях СО2 (известно, что кислотность клеточной среды обратно пропорциональна концентрации углекислого газа в атмосфере инкубатора). Так было показано, что при повышении концентрации СО2 интенсивность флуоресценции клеток возрастала, а значит, увеличивалось количество связанных антителами i-мотивов.
Таким образом, по мнению одного из авторов работы Махди Зераати, i-мотивы являются крайне динамичными структурами, способными к локальному формированию в определенных условиях в клетке, функционирующими как специфические регуляторы работы генов.