Усовершенствование методики секвенирования позволило по-новому взглянуть на роль экзосомной РНК
Ученые из Техасского университета в Остине и Калифорнийского университета в Беркли в процессе изучения РНК, входящих в состав внеклеточных везикул - экзосом, обнаружили, что вопреки ранее опубликованным данным экзосомы содержат полноразмерные молекулы РНК. Эта находка позволяет выдвинуть новые предположения о функциях экзосом и поставить под сомнение популярную гипотезу о том, что основная роль внеклеточных везикул – утилизация «клеточного мусора».
Известно, что внеклеточные везикулы представляют собой мембранные образования – пузырьки размером от 30 до 5000 нм, содержащие липиды, белки и РНК. Внеклеточные везикулы могут вырабатываться всеми клетками организма. Существует несколько типов внеклеточных везикул: микровезикулы, апотельца и экзосомы. Экзосомы имеют размер от 30 до 100 нм и образуются внутри клетки в специальных мультивезикулярных тельцах, высвобождаясь в межклеточное пространство путем экзоцитоза. Долгие годы среди биологов преобладало мнение, что экзосомы, также, как и апотельца (клеточные фрагменты, образовавшиеся в результате апоптоза), содержат лишь не несущий функциональной нагрузки клеточный дебрис и токсичные продукты метаболизма клеток. Это мнение во многом подкреплялось результатами анализа РНК, содержащейся внутри экзосом: в ходе РНК-секвенирования детектировалось большое количество фрагментированной РНК, кроме того, образцы также содержали некоторое количество интронных последовательностей белок-кодирующих генов.
В текущей работе ученые впервые применили новый способ РНК-секвенирования - TGIRT-seq (thermostable group II intron reverse transcriptase-III sequencing) c использованием термостабильной обратной транскриптазы GsI-IIC RT, которая сохраняет свою активность при повышенных температурах (оптимум активности для GsI-IIC RT составляет 61 °С, тогда как обычная обратная транскриптаза «работает» при 35 °С). Это преимущество обратной транскриптазы позволило разрушить (при помощи повышения температуры) вторичные структуры РНК и на матрице участвующих в их образовании РНК-последовательностей синтезировать кДНК. Таким образом, секвенирование полученной кДНК отражало последовательность РНК от начала до конца.
В результате этого эксперимента оказалось, что около 62% от всех РНК в экзосомах составили короткие некодирующие РНК, 27% пришлось на рибосомные РНК и около 6,6% - на РНК белок-кодирующих генов. При этом последовательности РНК не были фрагментированы. Более того, короткие некодирующие РНК на 80% были представлены транспортными РНК (тРНК), которые как известно, обладают очень стабильной вторичной структурой. Получается, что в ходе более ранних экспериментов с использованием обычной обратной транскриптазы большая часть тРНК оставалась «незамеченной».
Также в своей работе авторы использовали тройную схему очистки экзосом: на первом этапе с помощью ультрацентрифугирования осаждались внеклеточные везикулы, на втором использовалось разделение в градиенте сахарозы, позволяющее выделить экзосомную фракцию по размеру, и, наконец, на третьем этапе проводилась селекция экзосом с помощью моноклональных антител к тетраспанину CD63 (основному мембранному маркеру экзосом). Кроме того, ученые обрабатывали полученный препарат несколькими комбинациями растворителей, протеазами и нуклеазами, в результате чего было обнаружено, что большое количество ДНК из межклеточного пространства может «налипать» на наружную поверхность экзосом, тем самым внося «балласт» в результаты РНК-секвенирования. Исследователи предполагают, что ранее опубликованные данные о наличии интронных последовательностей в экзосомах на самом деле лишь свидетельствуют о нахождении участков интронов той самой «балластной» ДНК. Тем не менее, даже после избавления от ДНК-артефактов некоторые транскрипты белок-кодирующих генов внутри экзосом всё же были задетектированы.
В чем же заключается биологическая роль экзосомной РНК? В ходе экспериментов исследователям удалось обнаружить два любопытных момента, подтверждающих, что функции экзосом не ограничиваются утилизацией «ненужных» клетке молекул.
Используя вышеописанный метод TGIRT-seq для определения последовательности экзосомных РНК, было показано, что длина тРНК, находящейся внутри экзосом, была на 15 нуклеотидов меньше, чем у внутриклеточной тРНК. Причем при замене обратной транскриптазы GsI-IIC RT на транскриптазу TeI4c RT, относящуюся к тому же семейству термостабильных транскриптаз, но отличающуюся способностью читать модифицированные нуклеотиды, длина нуклеотидной последовательностей экзосомной и внутриклеточной тРНК совпадала. Получается, что экзосомные тРНК имеют модифицированный нуклеотид, расположенный в 16-й позиции с 5'- конца, в районе D-петли. Это наблюдение заставило ученых предположить, что тРНК, синтезируемая клеткой «на экспорт», претерпевает специальные посттранскрипционные модификации, после чего «экспортная» тРНК попадает в мультивезикуляирные тельца, где входит в состав экзосом. Однако это предположение требует дополнительной экспериментальной проверки.
Второй интересной «находкой», обнаруженной в ходе исследования, было определение связи между образованием экзосом и синтезом в клетке белка YBX1 (Y box-binding protein 1). Белок YBX1 известен как регулятор транскрипции и трансляции многих генов. Кроме того, последние исследования показали, что YBX1 может выделятся из клеток и присутствует в жидкостях организма, в том числе находясь внутри везикул. Также было показано, что уровень экспрессии YBX1 повышен в опухолях. В текущей работе, используя линию клеток, нокаутных по YBX1, ученые обнаружили, что в отсутствии экспрессии YBX1 тРНК накапливаются в клетках и не доставляются в экзосомы. Исследователи считают, что это открытие может пролить свет на понимание механизмов регуляции опухолевого микроокружения, ссылаясь на существующие работы, посвященные изучению путей распространения опухолей и демонстрирующие малигнизацию здоровых клеток посредством опухолевых везикул.
На данный момент ученым еще предстоит подробное изучение функций клеточных экзосом и содержащегося внутри них генетического материала, но, тем не менее, уже сейчас можно сказать, что их роль далеко не исчерпывается выделением клеточных «обломков».