Ученые обнаружили, что большинство из нас может обладать иммунитетом к генетическому редактированию методом CRISPR
Революционный метод редактирования генома человека с помощью бактериальной системы CRISPR/Cas9 был открыт 20 лет назад, активно исследовался с 2015 года, а уже в 2017 году в мире были проведены первые клинические исследования на людях. Однако, несмотря на теоретическую перспективность, генная терапия на основе CRISPR/Cas9 далеко не всегда способна принести желаемый результат
Известно, что наиболее распространенный вид белка Cas9, используемый в экспериментах, получен из двух штаммов бактерий - золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus – SaCas) и пиогенного стрептококка (Streptococcus pyogenes – SpCas), которые регулярно атакуют наш организм и с которыми наша иммунная система хорошо знакома.
Команда ученых во главе с Мэтью Портьюсом из университета Стэнфорда (США) провела исследование сыворотки пуповинной крови, полученной от 22 новорожденных младенцев, на предмет наличия антител к белкам Cas9. В результате было обнаружено наличие иммуноглобулинов класса G, известных своей способностью передаваться плоду от матери через плаценту, и к SaCas (у 86% доноров), и к SpCas (у 73% доноров). Полученные данные заставили ученых продолжить эксперименты по поиску антител в сыворотке крови взрослых: было исследовано 12 образцов периферической крови, полученных от здоровых доноров. Специфические IgG против SaCas были найдены у 67% доноров, а IgG против SpCas – у 42%.
«Наша иммунная система постоянно сталкивается с инфекциями, вызываемыми данными штаммами, поэтому неудивительно, что у большого количества людей в крови уже существуют антитела против антигенов, присущих этим возбудителям», - прокомментировал полученные результаты Мэтью Портьюс.
На следующем этапе авторы работы решили проверить, ограничивается ли предсуществующий иммунитет против Cas9 гуморальным звеном. Для исследования клеточного иммунитета ученые использовали специальный метод захвата цитокинов (cytokine capture system – CCS). Из 13 образцов венозной крови здоровых доноров были выделены мононуклеарные клетки (PBMC - peripheral blood mononuclear cells), которые обрабатывали антигеном (белком Cas9) in vitro. В результате такой обработки антигенпрезентирующие клетки, присутствующие в массе PBMC, связывались с антигеном и презентировали его на своей поверхности в составе молекул MHC Т-клеткам. Активированные таким способом Т-клетки начинали вырабатывать гамма-интерферон (IFN-γ), детекцию которого проводили с помощью соответствующих антител в ходе проточной цитометрии. В качестве положительного контроля применялась обработка PBMC смесью из 17 вирусных антигенов, а в качестве отрицательного контроля вместо PBMC использовались Т-клетки пуповинной крови, которые не могли ранее контактировать с белком Cas9. В результате было показано, что в 46% образцов после стимуляции антигеном (SaCas) уровень IFN-γ повысился в 5 раз, причем клеточный ответ наблюдался как со стороны CD4+ Т-клеток, так и со стороны CD8+ Т-клеток. Кроме того, на поверхности Т-клеток начинали экспрессироваться такие маркеры активации, как CD69, CD25 и CD154. Также в некоторых образцах активированные Т-клетки наряду с IFN-γ вырабатывали также TNF-α. При этом у 2/3 доноров, имеющих в крови антиген-специфичные Т-клетки, были также обнаружены соответствующие IgG против SaCas. При стимуляции PBMC белком SpCas авторами не было получено воспроизводимых результатов, что, однако, не говорит об отсутствии клеточного ответа на данный антиген. Возможно, для его изучения требуются другие методики и подходы.
Авторы подчеркивают, что обнаруженный Т-клеточный ответ против SaCas был строго антиген-специфичным и обуславливался предыдущими контактами иммунной системы доноров с антигеном, так как при культивировании выделенных CD4+ и CD8+ Т-клеток на фидерном слое, они селективно реагировали на рестимуляцию SaCas повторной выработкой IFN-γ.
Полученные результаты ставят под сомнение широкое применение систем редактирования генома при помощи систем CRISPR/Cas9.
По словам авторов исследования, предсуществующий гуморальный иммунитет против белка Cas9 еще можно «обмануть» используя такие методы доставки Cas9, как электропорация клеток ex vivo с последующей трансплантацией отредактированных клеток в организм пациента или in vivo инъекции трансгена совместно с Cas9 в составе наночастиц. Описанные способы не предусматривают прямого взаимодействия белка с Ig крови, поэтому предсуществующие в крови антитела не будут снижать эффективность генной терапии. Однако если Cas9 будет доставляться в организм в составе рибонуклеопротеидных комплексов, то специфичные антитела хозяина могут блокировать последние, снижая тем самым эффективность лечения.
Намного большую проблему, по мнению исследователей, представляют присутствующие в крови больных субпопуляции Т-клеток, специфичных к Cas9. В предыдущих генно-терапевтических исследованиях с применением системы редактирования CRISPR/Cas9 было показано, что такие Т-клетки способны полностью элиминировать клетки, несущие на своей поверхности фрагменты белка Cas9 (в составе комплекса MHC I-белок), что сводит к нулю эффективность генной терапии. По мнению авторов, любые методы, предполагающие длительную экспрессию белка Cas9 в организме, могут вызвать экспансию Т-клеток памяти и развитие сильного Т-клеточного ответа. Более того, возникает серьезный риск развития генерализованного воспалительного процесса, затрагивающего не только органы-мишени, на которые была изначально направлена генная терапия, но и весь организм.
Тем не менее, ученые не предлагают вовсе отказаться от использования систем редактирования генома на основе CRISPR/Cas9. Например, в методах редактирования ex vivo авторы рекомендуют продлить стадию культивирования «отредактированных» клеток перед трансплантацией, чтобы полностью элиминировать Cas9, экспрессирующийся на их поверхности.
Кроме того, рассматриваются также варианты использования иммуносупрессоров во время и после проведения генной терапии. Также возможно использования белка Cas9, полученного от других, более редких штаммов, с которыми ранее не сталкивалась наша иммунная система. В качестве альтернативного варианта авторы предлагают создание рекомбинантных белков Cas9, способных «обойти» как гуморальный, так и клеточный ответ пациента.